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坂下 哲哉; 浜田 信行*; 川口 勇生*; 大内 則幸; 原 孝光*; 小林 泰彦; 斎藤 公明
no journal, ,
コロニー形成能の測定は、放射線照射後の細胞の重要な情報を与える。通常、50個以上の細胞からなるコロニーを、増殖可能な細胞からなるコロニーとして生存率を評価してきた。しかし、従来無視されてきた50個に満たない細胞からなるコロニーに関して詳細に調べたところ、サイズ分布が対数-対数グラフで直線にプロットできることがわかった。本研究では、この直線関係について分岐プロセスモデルを導入し、世界で初めて照射後の数世代にわたる細胞増殖死の確率を推定できることを発見した。また、従来、増殖可能なコロニーとして評価されたてきた生存コロニーに、このモデルを拡張応用することにより、生存率曲線を再現することに成功した。この一連の解析により、放射線照射後の細胞の継世代的な影響には、比較的短い数世代に及ぶ増殖死が高まる影響と、それよりも長い世代にわたって継続する増殖死の機構が存在することを明らかにした。
鈴木 芳代; 服部 佑哉; 坂下 哲哉; 舟山 知夫; 横田 裕一郎; 池田 裕子; 小林 泰彦
no journal, ,
動物の細胞・組織レベルでの放射線応答・影響に関する知見は蓄積されてきているが、個体の行動レベルでの放射線応答・影響に関する知見は限定的である。そこで、発表者らは、線虫を対象として放射線の運動機能への影響を調べ、全身運動及び咽頭ポンピング運動(餌の咀嚼・嚥下)が放射線の全身照射により一時的に低下あるいは停止することをこれまでに明らかにした。本研究では、線虫の体のごく一部を狙って放射線を照射し、全身照射直後のような運動の変化が観られるか、照射部位によって運動の変化に違いがあるかを明らかにすることを目的とした。原子力機構のマイクロビーム細胞局部照射装置を用いて、線虫(成虫)の神経細胞が密集する頭部、腸などがある中央部、尾部のエリアを狙って炭素イオンマイクロビームを照射した。照射直後に線虫を寒天平板上に移して運動を撮影し、その画像をもとに全身運動については20秒間の頭部屈曲回数、咽頭ポンピング運動については1秒間のポンピングストローク数を計数した。線虫の全身運動は、頭部,中央部,尾部のいずれへの局部照射でも低下するものの、全身照射のような顕著な低下とはならなかった。一方、咽頭ポンピング運動は、頭部,中央部,尾部のいずれへの照射でも非照射と変わらず、全身照射のような顕著な運動の低下や停止は生じなかった。以上から、照射範囲や筋運動の種類によって放射線の影響の現れ方が異なることが明らかになった。
服部 佑哉; 鈴木 芳代; 舟山 知夫; 小林 泰彦; 横谷 明徳; 渡辺 立子
no journal, ,
本研究では、細胞集団中の細胞間コミュニケーションの時間・空間的な動態を計算可能な数理モデルを構築し、照射する放射線の線量や照射領域によってコミュニケーションがどのように変化するのか、その結果、細胞集団にどのような放射線応答が現れるのかを明らかにすることを目的とする。提案する放射線応答モデルでは、細胞周期と細胞死を表現する1細胞の細胞モデルを、2次元平面の培養液上に複数配置して細胞集団を表現する。細胞間の伝達物質は、細胞モデルの状態を細胞周期停止と細胞死にスイッチングさせるギャップ結合経由の物質X、培養液経由の物質Yとして表現する。物質Xの伝達は、隣接する細胞モデル内の物質Xの濃度差をもとに計算し、物質Yの伝達は、2次元平面の培養液を格子で分割し、隣接する格子内の物質Yの濃度差をもとに計算する。講演では、放射線照射によって照射細胞モデル内の物質Xと物質Yの濃度が上昇したときに、それぞれの物質が隣接する細胞・培養液を介して非照射細胞モデルを含んだ集団全体へ伝達する様子と細胞集団中の個々の細胞モデルの状態について、線量や照射領域を変えた計算結果の一例を示し、本モデルの有用性を報告する。
坂本 綾子; 秋田 睦; 遠藤 真咲*; 土岐 精一*
no journal, ,
AtPol
, AtPol
およびAtRev1は真核生物で保存されている損傷乗り越え型DNAポリメラーゼのシロイヌナズナにおけるホモログであるが、これらを欠失させると紫外線によって生長が抑制されることから、植物の紫外線応答において重要な役割を果たすことが示唆されている。GUS遺伝子をマーカーとした復帰突然変異検出実験では、AtPolやAtRev1を欠損すると紫外線誘発突然変異頻度が大きく減少する一方で、AtPolを欠失すると突然変異頻度が上昇した。このことから、AtPolやAtRev1は紫外線損傷を乗り越える際にエラーを起こしやすいのに対し、AtPolはエラーを起こしにくいことが予想された。一方で、AtRev1は他のポリメラーゼのサブユニットやPCNAなどの複製装置蛋白質と相互作用することから、紫外線応答で必要な蛋白質を複製フォークに呼び込む機能を持つことが示唆されている。今回、我々は相同組換えマーカーを組み込んだシロイヌナズナを用い、AtPolまたはAtRev1を欠失させた際に相同組換え頻度が変化するかどうかを解析した。その結果、AtRev1を欠失すると組換え頻度が一様に減少したが、AtPolを欠失させると一部のマーカーでのみ相同組換え頻度が上昇するという結果が見られた。このことから、AtPolとAtRev1は相同組換えの制御において異なる機能を持つことが示唆された。さらに、損傷乗り越え複製型ポリメラーゼが植物のゲノム安定性維持に関わる様々な機能に関与する可能性が示された。
野口 実穂; 嘉成 由紀子; 藤井 健太郎; 横谷 明徳
no journal, ,
細胞周期に依存して放射線感受性が変化することは古くから知られている。一般に、M期で最も高く、S後期で最も高い。一方、ミトコンドリアの形態も細胞周期に依存して変化していることが最近明らかになった。ミトコンドリアは環境に応じて形態を断片化から融合状態まで変化させるが、M期では断片化し、G1とS期の境目では非常に長くつながった状態になる。それ以外の周期では断片化と融合状態の中間体を形成している。そこで、本研究では細胞周期に依存する放射線感受性とミトコンドリア形態変化の関連性を明らかにするため、照射を受けた細胞周期の違いによりミトコンドリアの形態変化が異なるかどうかを調べた。マウス細胞にX線を照射し、照射直後にM期細胞のみをmitotic shake off法により回収してディッシュにまき、照射24時間から96時間までのミトコンドリアの形態変化を蛍光顕微鏡にて観察した。その結果、ミトコンドリアの断片化はM期の照射、他の周期での照射ともに照射後72から96時間でピークになることが明らかになった。この結果から、照射後のミトコンドリア断片化誘導には照射を受けた細胞周期は関係性が少ないと考えられる。
尾田 正二*; 保田 隆子*; 浅香 智美*; 三谷 啓志*; 池田 裕子; 武藤 泰子*; 横田 裕一郎; 鈴木 芳代; 舟山 知夫; 小林 泰彦
no journal, ,
原子力機構・高崎TIARAの重イオンマイクロビーム装置を用いて炭素イオンマイクロビームでメダカの稚魚および成魚の精巣を選択的にin vivo照射することに成功した。体躯が透明なふ化直後の稚魚の照射では、生殖細胞特異的にGFPを発現するトランスジェニックメダカを用い、蛍光で特定した清掃の所在にマイクロビームで照準照射したところ、精巣の蛍光が消失した。また、体躯が不透明であるメダカ雄成魚に対しては麻酔下にて腹腔内の精巣の位置を正確に推定し、精巣の形状に沿ってマイクロビームを重ならないよう多重照射し、精巣を選択的に照射する手法を開発した。この方法を用いて照射したp53ノックアウト雄メダカでは、放射線照射によって精原細胞が卵細胞に異常分化・増殖する精巣卵が顕著に誘導され、これを放射線照射の指標として用いることで精巣選択的なin vivo照射が可能であることが示された。
鈴木 雅雄*; Autsavapromporn, N.*; 舟山 知夫; 横田 裕一郎; 武藤 泰子*; 池田 裕子; 鈴木 芳代; 服部 佑哉; 坂下 哲哉; 小林 泰彦; et al.
no journal, ,
重イオンマイクロビームを照射した細胞から湧出する因子によるバイスタンダー効果誘導を明らかにする目的で、マイクロビーム照射後の細胞致死効果の時間変化を調べた。重イオンマイクロビーム照射には、日本原子力研究開発機構TIARAの細胞局部照射装置を用いた。照射後培養液を添加し、0.5, 3, 24時間インキュベーター内に保持し、それぞれのタイミングでの細胞増殖死をコロニー形成法で調べた。その結果、アルゴンイオン照射試料で、ギャップジャンクション阻害剤やDMSOの添加では抑制されないが、アスコルビン酸の添加によって抑制される何らかの因子によって、細胞致死効果を増幅するようなバイスタンダー効果が誘導されることが示唆された。
舟山 知夫; 横田 裕一郎; 坂下 哲哉; 鈴木 芳代; 池田 裕子; 小林 泰彦
no journal, ,
これまで原子力機構・高崎では、コリメーション式及び集束式の重イオンマイクロビーム細胞照射装置の開発とそれらを用いた生物照射効果解明研究を行ってきた。コリメーション式重イオンマイクロビーム装置では、これまで培養細胞のみならず、カイコや、植物組織,線虫,メダカ胚などの照射を行い、細胞への重イオンヒット効果や、バイスタンダー効果などの放射線応答を解析すると共に、重イオンの局部照射による組織内の特定部位の不活性化によるラジオサージェリー研究などを行ってきた。これらの実績を踏まえ、現在、このコリメーション式重イオンマイクロビーム装置に、超高感度カメラを核としたライブイメージング解析システムを組み込み、バイスタンダー効果における細胞集団全体の応答を解明するシステムの構築を進めている。また、コリメーション式よりも小さいビームスポットを用いて精密かつ高速な照射を実現するために開発を進めてきた集束式重イオンマイクロビーム装置では、ビームスキャナを用いた細胞への高速スキャン照射技術の開発を進めている。発表では、これらの開発の現状について概説する。
線により誘発されるバイスタンダー効果の線質依存性と時間依存性の解析横田 裕一郎; 舟山 知夫; 池田 裕子; 武藤 泰子*; 鈴木 芳代; 坂下 哲哉; 小林 泰彦
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照射細胞の周辺に存在した非照射細胞にも放射線の効果が伝わるバイスタンダー効果の線量応答と照射細胞数の影響を調べた。ヒト培養細胞の細胞集団の33%に炭素イオン(108keV/
m)あるいは線(0.2keV/m)を照射し、照射細胞と残りの非照射細胞を多孔性メンブレンの両側で6から24時間共培養したとき、非照射バイスタンダー細胞の生存率は低下した。この際、バイスタンダー細胞の生存率は線量の増加につれて80%まで低下したが、0.5Gy以上の線量では下げ止まり、線量応答は炭素イオンと線で同様だった。以上の結果から、バイスタンダー効果は線量に部分的に依存するが、線質には依存しないことがわかった。一方、炭素イオンあるいはネオンイオン(380keV/m)を細胞集団の0.001%だけにマイクロビーム照射したとき、細胞集団全体の生存率は培養6時間後には変化しなかったが、24時間後には低下した。このことから、照射細胞の割合が減少すると、バイスタンダー効果の誘導時間が延びる可能性が示唆された。
坂本 由佳; 野口 実穂; 藤井 健太郎; 横谷 明徳
no journal, ,
スフェロイドとは細胞が多数凝集して3次元状態になったものを指す。通常のディッシュ等を用いての単層培養に比べると長期間細胞の機能を維持でき、より生体に近い培養方法であると言える。これまで放射線に対する細胞応答の研究は数多くなされてきたが、その多くは単層培養した細胞についてであった。本研究では、X線照射に対するスフェロイドの感受性とDSBの発生頻度との相関を明らかにすることを目的とし、スフェロイドを作成するための様々な条件を検討した。その結果、低付着性のマルチプレート培養ディッシュを用いることで、数100マイクロメーター程度のヒト細胞(HeLa細胞)のスフェロイドが安定して作成できることを確認した。共焦点顕微鏡によりスフェロイド内部の細胞状態を観察したところ、500マイクロメートル程度の大きさまで成長したスフェロイドではその内部が低酸素のため分裂死を起こしていることが分かった。このため実験には、これより小さなスフェロイドを用いることが必要である。得られたスフェロイドに対してX線照射を行い、コロニー形成法で調べた生存率を単層培養細胞の結果と比較しところ両者に大きな差はなかった。
嘉成 由紀子; 野口 実穂; 藤井 健太郎; 横谷 明徳
no journal, ,
Fucci化したヒト正常細胞を用い、タイムラプス法により細胞内のエネルギー分子であるAPTを産生するミトコンドリに放射線照射によりどのような影響が現れるかを調べている。今回、ミトコンドリア膜電位に依存して緑から赤に蛍光発色がシフトするJC-1をプローブとして用い、照射細胞中のミトコンドリアの活性状態が継時観察できる実験系を構築した。この系を用いて放射線照射後数日間に渡りミトコンドリアの動態及び膜電位の変動を観測した結果、照射後の細胞にはミトコンドリアを含む細胞質の体積増加が見られた。さらに、ミトコンドリアの膜電位の変化や細胞質内での運動状態が照射により亢進した。これらの結果から、ミトコンドリアの絶対数の増加により照射細胞内のエネルギー供給が増加し、またこれに伴い細胞内での活動量も増加していることが推測された。今回JC-1をプローブとしたライブセルイメージングの系が確立されたことから、今後さらにミトコンドリアを含め細胞内小器官の状態変化を詳細に調べることで、放射線照射による細胞内代謝過程への影響を明らかにして行く予定である。
池田 裕子; 横田 裕一郎; 舟山 知夫; 金井 達明*; 小林 泰彦
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本研究では、バイスタンダー効果が重粒子線がん治療に及ぼす影響を明らかにするため、細胞種の組合せを変えて炭素線誘発バイスタンダー効果の誘導を検討した。培養液経由のシグナル伝達によるバイスタンダー効果を検出するための共培養実験では、正常細胞としてヒト胎児肺由来正常線維芽細胞株WI-38を、がん細胞としてヒト肺がん細胞H1299/wt
を使用した。炭素線ブロードビーム全体照射(LET=108keV/m, WI-38:0.13Gy, H1299/wt:0.5Gy)した細胞と、非照射細胞を非接触で6時間または24時間共培養した後、非照射細胞のみを回収してコロニー形成を行い、得られたコロニー形成率から生存率を算出して、同細胞種間と異細胞種間で結果を比較した。種々の組み合わせで共培養実験を実施したところ、炭素線誘発バイスタンダー効果が異なった細胞種に培養液を介して働く場合には、非照射細胞のコロニー形成能を高めることが示唆され、異細胞種間と同細胞種間では培養液経由のバイスタンダー応答に大きな違いが生じることが分かった。
神長 輝一; 成田 あゆみ; 野口 実穂; 横谷 明徳
no journal, ,
細胞に放射線が照射されると細胞周期がある個所で停止並びに遅延を起こす現象は以前から報告されてきた。しかし、これらの研究の多くはフローサイトメトリーなどの細胞集団を対象とした解析によるものだった。今回我々は、Fucci細胞を蛍光顕微鏡下で培養しながら個々の細胞を長時間経時観察することで細胞周期変化の解析を行った。その結果、比較的高い線量(5Gy)での細胞周期遅延時間は、約3時間程度であった。さらに、バイスタンダー効果により、非照射細胞にも周期変化が誘発されることも見出した。バイスタンダー効果による細胞周期への影響はこれまで研究例がなく、本研究が初めてである。今後は、バイスタンダー効果の伝達経路として考えられているギャップジャンクション並びに、培地中に放出されるバイスタンダー因子のキレート剤を用いてそれぞれの経路を遮断することで、各経路の細胞周期変化への寄与を突き止める予定である。